S. I. M. T. I.
La trasfusione del sangue
Volume 43, Numero 2, Marzo - Aprile 1998
Efficacia del risultato: nuovo parametro di confronto fra test di screening ELISA verso il virus dell’epatite C
arco ROSSI DE GASPERIS, Laura PANSANI, Maria Daniela CAIONE, Carlo CONCATO, Giuseppe PIZZICHEMI, Micaela CARLETTI, Donato MENICHELLA Servizio di virologia, ospedale "Bambino Gesù", Istituto di ricerca scientifica.
Responsabile del Servizio: Dott. Donato Menichella
We studied a population of 183 sera obtained from the Day hospital, blood bank and from both in- and out-patient clinics of the paediatric hospital “Bambino Gesù”. Sera was screened with four 3° generation enzyme-linked immunoassay (ELISA) kits for detection of antibodies against hepatitis C virus (anti-HCV). All the samples, reactive by ELISA or with a signal to cut-off ratio between 0.2 - 1.0 were retested with RIBA-3 and MATRIX II. The results showed that using more than one kit increases the significance of the results and enhances test sensitivity without hampering efficacy. The combination of screening kits which offered the best sensitivity and efficacy was identified. PAROLE CHIAVE: HCV, ELISA, anticorpi, confronto, efficacia. KEY WORDS: HCV, ELISA, antibody, comparison, efficacy.
INTRODUZIONE E SCOPO La determinazione della sequenza genomica del virus dell’epatite C, responsabile della maggior parte delle epatiti non-A non-B trasmesse per via ematica, ha permesso l’introduzione di diagnostici per la rilevazione di anticorpi verso tale virus 1. Dai test ELISA anti-HCV di 1ª generazione che impiegavano come antigene la proteina ricombinante c-100, derivante dalla regione NS4 del genoma virale, si è passati ai test di 2ª generazione che erano in grado di riconoscere gli anticorpi diretti contro il core e la regione non strutturale NS3 2. Con l’ELISA di 3ª generazione, assieme ad una migliore ricostruzione antigenica, si è aggiunta anche la possibilità di ricercare gli anticorpi contro la regione non strutturale NS5. I test di conferma completano oggi l’indagine definendo e quantificando gli anticorpi verso gli antigeni strutturali e non del virus 2. I kit in commercio utilizzati per dosare gli anticorpi anti-HCV con il metodo ELISA, se usati individualmente, potrebbero non essere in grado di identificare tutti i campioni positivi o border-line che dovranno essere confermati successivamente con i test supplementari. D’altra parte, non è economicamente possibile saggiare tutti i campioni direttamente con i test di conferma. Per aumentare la sensibilità dello screening per la ricerca degli anticorpi anti-HCV e per far sì che non possano sfuggire all’osservazione i positivi a bassa reattività (immunodepressi, trapiantati, HIV positivi, etc.) bisognerebbe utilizzare in combinazione alcuni kit ELISA. Lo scopo del nostro studio è quello di individuare due diagnostici che, utilizzati insieme, possano fornire la migliore sensibilità con la migliore efficienza del risultato finale.
MATERIALI E METODI E’ stata eseguita un’indagine per la ricerca di anticorpi anti-HCV con la tecnica ELISA su 183 campioni di siero provenienti da tutti i reparti di degenza, Day-Hospital, Centro Trasfusionale e Ambulatorio dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù. Sono stati utilizzati per il test di screening quattro kit ELISA di 3ª generazione (ORTHO HCV 3 - SORIN ETI-Ab HCV K 3 - ENZYMUN A-HCV BIOCHEMIA (kit da ricerca) -MUREX HCV-III 1ª versione (kit da ricerca). I campioni di siero sono stati lavorati nelle stesse condizioni strumentali con l’apparecchiatura automatica LABOTECH della ditta CHEMILA, ad eccezione del kit BIOCHEMIA che risulta essere dedicato allo strumento ES- 600. Successivamente i campioni risultati positivi o border-line al cut-off, calcolato secondo le istruzioni delle ditte, sono stati sottoposti al test supplementare di terza generazione CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA utilizzando la strumentazione automatica PROFIBLOT e a quello di conferma dell’ABBOTT “MATRIX II.” Vista la particolare situazione immunitaria di alcuni pazienti e lo scopo dell’indagine, sono stati saggiati con entrambi i test di conferma anche tutti quei campioni di siero che all’ ELISA avevano riportato un indice di cut-off compreso tra 0,2 e 0,8, cioè inferiore di circa 2/3 il valore limite.
RISULTATI La popolazione di pazienti è stata suddivisa in due gruppi: positivi e negativi, in accordo con i risultati ottenuti dai test di conferma RIBA e MATRIX e seguendo i criteri descritti nella tabella I, in cui il risultato “indeterminato” ad un test di conferma e “positivo” all’altro viene considerato per convenzione positivo e viceversa “l’indeterminato” per un test ed il “negativo” per l’altro, viene considerato negativo. In base a questa classificazione dei 183 campioni, 134 sono stati considerati negativi e 49 positivi, i risultati ottenuti dai differenti test sono riportati in tabella II. Dalla stessa, benchè la popolazione contenga un piccolo numero di campioni positivi, è possibile avere un’indicazione della sensibilità relativa dei differenti test. Nessuno dei quattro kit ELISA considerati ha mostrato un valore di sensibilità equivalente o maggiore del 90%, a fronte di una ottima specificità. Se consideriamo il parametro "efficacia del risultato", calcolato con la formula: (Veri Positivi + Veri Negativi) / (Veri Positivi + Veri Negativi + Falsi Positivi + Falsi Negativi x 100 3 otteniamo i dati descritti nella Tabella III. Essendo, però, la sensibilità un parametro importante nella valutazione del prodotto designato per l’identificazione degli agenti eziologici, abbiamo voluto mettere a confronto la sensibilità di ogni kit in funzione dell’efficacia ottenendo i valori espressi nella tabella IV. Se utilizziamo in parallelo due test di screening, per dosare la reattività anticorpale dei campioni, aumentiamo la significatività del risultato, migliorandone la sensibilità senza penalizzare troppo l’efficacia; in particolare possiamo osservare tutte le combinazioni possibili fra kit nella tabella V. Volendo poi privilegiare la sensibilità per motivi diagnostici, la combinazione migliore fra i test sembra essere SORIN-ORTHO, giungendo ad una sensibilità del 95,92 % con una efficacia del 93,44%. Con questa combinazione, però, non venivano individuati due falsi negativi: il campione 39 che mostrava una reattività isolata di 3+ all’NS5, probabilmente aspecifica, e il campione 177 reattivo all’NS3 con 2+ (quest’ultimo non è stato evidenziato da nessuno dei test studiati).
CONCLUSIONI Questo studio indica che nessuno dei quattro test di screening ELISA valutati è stato in grado di evidenziare da solo tutti i campioni positivi contenuti nella popolazione studiata . Nella casistica considerata, se si fosse utilizzato un solo kit, si sarebbero dovuti confermare tutti i positivi riscontrati (VP + FP) eseguendo saggi RIBA e/o MATRIX tra un minimo di 34 ed un massimo di 48, perdendo comunque un significativo numero di veri positivi. Poichè non è possibile testare tutti i campioni in routine con gli attuali test di conferma a disposizione, potrebbe essere molto utile saggiarli in parallelo con due differenti kit di diagnostici. Tutti i sieri che hanno dato concordanti risultati positivi con almeno due test si sono confermati positivi con RIBA e/o MATRIX e di conseguenza il doppio dosaggio concordemente positivo potrebbe eliminare la necessità di confermare il risultato con tecnologie alternative ed altamente costose. Nessuno dei campioni falsi positivi è risultato tale contemporaneamente per due o più test. Questi risultati ci fanno considerare che le proteine usate dalle varie ditte sembrano essere differenti tra loro per sequenza o reattività per cui l’uso di un test ELISA in singolo potrebbe non essere sufficiente ad identificare sieri di pazienti che per patologia o per terapia immunosoppressiva hanno una scarsa reattività anticorpale o quei campioni bassi positivi che rappresentano un rischio di infezione nelle trasfusioni di sangue.
RIASSUNTO Su campioni di siero provenienti da tutti i reparti di degenza dell’Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, dall’Ambulatorio e dal Centro Trasfusionale sono stati effettuati, con quattro kit diversi in contemporanea e nelle stesse condizioni strumentali, test di screening ELISA per l’HCV di 3ª generazione. Successivamente, i campioni sicuramente positivi e quei sieri che all’analisi ELISA rilevavano un rapporto D.O/C.O inferiore a 1 (0,2-0,8) sono stati confermati al RIBA 3 e MATRIX II. E’ stata ricercata quella combinazione fra kit che potesse fornire la migliore sensibilità con la migliore efficienza del risultato finale. Calcolata l’efficacia del risultato, successivamente è stata valutata la sensibilità in funzione della stessa. Lo studio ha evidenziato che l’uso di più kit contemporaneamente aumenta la significatività del risultato, migliorando la sensibilità senza penalizzare troppo l’efficacia.
BIBLIOGRAFIA 1) Uyttendaele S, Claeys H, Mertens W et al.: Evaluation of third-generation screening and confirmatory assays for HCV Antibodies. Vox Sang, 66, 122, 1994. 2) Zaaijer HL, Vrielink H, Van Exel-Oehlers PJ et al.: Confirmation of hepatitis C infection: a comparison of five immunoblot assays. Transfusion, 34(7), 603, 1994. 3) National Committee for Clinical Laboratory Standards (N.C.C.L.S): Specification for immunological testing for infectious diseases. Approved Guideline, N.C.C.L.S. Document I/LA 18-A, 12-91. 14(18), 3, 1994.
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